近年来，基因治疗引起了行业极大的兴趣，即通过将核酸作为活性生物药物应用于该类治疗，作为纠正遗传异常的一种方法，或用于基因疫苗接种以诱导免疫反应。非病毒载体，如质粒DNA (pDNA)，正在当前的各种临床试验中进行研究和评估，超螺旋(sc) 质粒因其更高的安全性、完整性和生物效率而受到特别关注。
pDNA 的生产通常以重组大肠杆菌（E.coli）宿主的发酵进行，约占E.Coli提取物总成分的3% w/w（图 1）。考虑到含有 pDNA 的裂解物中存在的所有杂质，美国食品和药物管理局(FDA) 和欧洲药品管理局 (EMA) 等监管机构提出了若干标准，必须满足这些标准才能制备用于治疗应用的 sc pDNA。因此，必须将 pDNA 从细胞碎片和其它杂质（如RNA、蛋白质和基因组 DNA (gDNA)）中完全分离出来。这些杂质中的大多数与 pDNA 具有一些相似的物理化学特性，如负电荷（RNA、gDNA 和内毒素）、分子量（gDNA和内毒素）和疏水性（内毒素），这高度限制了分离过程。目前，用于pDNA 回收和纯化的工艺包括多个连续的操作步骤，它们结合起来以实现最大的sc pDNA 回收和纯度水平，并最大限度地减少pDNA 降解（图 2）。本文的重点是 pDNA 的层析纯化，因为这是最重要的步骤之一，对目标生物分子的质量以及生物技术过程的整体效率、可持续性和稳健性有很大影响。pDNA纯化中不同类型层析方法的应用已经得到广泛的评估。因此，本文旨在从不同的角度，展示研究工作如何集中在支持物的改进和配基的设计上，以作为克服pDNA 纯化挑战的一种方式，从而回答与 pDNA 纯化相关的一般困境，继而寻求更高的结合载量或增强的选择性。
图1. E.Coli裂解物的平均组成。
图2. 用于pDNA生产的一般上游和下游工艺步骤。
pDNA的层析纯化
通过层析法纯化质粒涉及与裂解物中存在的生物分子的多样性及其特征（例如大小、形状、构象和流变特性）相关的一些问题。此外，大多数杂质，如RNA、gDNA 或内毒素，与 pDNA 共享一些特性，这对它们的分离提出了一些挑战。去除这些杂质非常关键，以至于研究人员从下游工艺的一开始就尝试去除或减少它们，甚至在主要纯化工艺之前。gDNA 水平的降低通常通过在碱裂解过程中进行变性来实现，并且可以通过在澄清阶段添加RNA 消化酶或包括盐沉淀步骤来降低 RNA 含量。但是，如果打算纯化用于生物治疗的药物，则不能选择通过 RNase 消化 RNA，因为根据监管机构的标准，不允许使用动物来源的酶。内毒素的去除非常重要，因为E.Coli的这种脂多糖成分如果在体内大量存在，会产生中毒性休克综合征的症状。内毒素的消除通常在纯化步骤中通过层析法进行。
从历史上看，用于 pDNA 纯化的第一种方法是基于蔗糖或氯化铯-溴化乙锭密度梯度超速离心。然而，这些方法耗时且难以规模放大，并且还使用有毒和致突变试剂，使其不适用于pDNA的制备。为了克服这些障碍，液相层析已成为保证回收的pDNA 产品质量的核心技术。层析可以探索诸如大小、电荷、疏水性、核苷酸碱基的可及性、拓扑特征和/或亲和性等性质，促进 pDNA 和层析基质之间的相互作用，基于特定的选择性和分辨率，最终回收所需的sc pDNA 物质。最初，研究发现存在与可用基质结合大分子（如pDNA）的低载量有关的巨大限制。此外，对于具有更高载量的填料，由于pDNA 和杂质之间的相似性，它们通常缺乏很好的选择性。这是重新开发层析支持物策略的起点。
重新发明层析支持物
层析是一种表征明确且成熟的方法，最初用于纯化小分子，然后自1950 年代起主要用于制药行业的蛋白质纯化。为进行蛋白质纯化而生产的第一批基质由平均尺寸在50 – 500 μm 之间且孔径在 30 nm 左右的颗粒构成。这种尺寸不适用于pDNA 纯化，因为常见层析填料的平均孔径通常更小或与pDNA 分子的回转半径大小相同。这一特性是导致pDNA 进入标准层析支持物的孔隙受限的原因。多年来，用于pDNA 纯化的层析支持物的开发试图克服与这些分子扩散或结合载量相关的限制，并推动了对不同支持物的研究，如超多孔基质、整体柱或吸附膜。
最常用的 pDNA 初步捕获方法是阴离子交换层析法 (AEXC) ，但其它层析技术也可以从裂解物中分离 pDNA，例如尺寸排阻层析法 (SEC)、疏水相互作用层析(HIC)以及亲和层析 (AC)。
如上所述，AEXC 是最常用的层析技术，即用于 pDNA 纯化的市售试剂盒，例如可从Promega、Qiagen 或 NZYTech 获得的试剂盒。然而，重要的是，使用AEXC，pDNA 可以与 gDNA、高分子量RNA 和内毒素共洗脱，因为这些分子对阴离子交换基质具有相似的亲和性。为了部分解决这个问题，当pDNA 用于分子生物学方案时，通常添加 RNase A 来降解 RNA 杂质。除了所涉及的明显成本外，还有对RNase 的担忧，因为它是从牛胰腺中纯化的，并且如前所述，监管机构建议在生物治疗药物的生产中应避免使用源自牛的材料。
Q-Sepharose 阴离子交换含有季胺基团(Q)，主要用于球状蛋白纯化。至少，从理论上讲，这种支持物并不最适合质粒纯化的特性，主要是由于孔径小，这限制了这些分子进入孔隙。此外，这类问题也会导致低结合载量。为了抑制这种载量限制，已经开发了诸如来自MERCK 的 FractogelEMD DEAE 之类的基质。该基质由具有较大表面积的基球构成，包含耦合的聚合物触手和大孔，可以有效捕获pDNA，最终获得更高的结合载量。此外，市场上也有由超多孔琼脂糖基球制成的基质，其可以包含两组孔，即扩散孔和所谓的超孔或流动孔，其中层析液流可以将物质输送到每个基球的内部，从而增加基球的表面积，也增加了这些基质的结合载量。超多孔琼脂糖基球具有较大的连通流动孔，其尺寸范围为基球总直径的1/4 到 1/20。超孔隙率不仅提高了 pDNA 进入内部空隙的能力，而且还允许发生对流孔隙流动，从而改善内部质量传递。例如，Deshmukh等在2005 年开发了 CEL-BEADS，其孔径约为 3μm，可实现1.4 mg/mL 的 pDNA 动态结合载量，在批次和柱模式下的回收率分别为 77% 和 52%。最终的质粒产物不含RNA、gDNA、蛋白质和内毒素。
表2. 用于pDNA纯化的层析支持物的特性。
还生产了可以调整颗粒/孔径的颗粒，以使其适应其用途，例如，取决于它们在核酸分析或大规模纯化中的用途。来自Tosoh 的 Butyl-6PW 和 octyl-6PW 就是这种支持物生产的多功能性的例子。这些基质依次使用，第一个支持物负责截留RNA 和蛋白质，第二个负责吸附 pDNA 和 gDNA。在这种方法中，介绍其可获得1.1 mg/mL 的载量和 90% 的 pDNA 收率。该工艺通过使用AEXC 的最后精纯步骤完成，以完全去除所有杂质。
随着新方法的发展，Pall的 Mustang 或BIA Separations 的CIM monoliths 等已被开发并应用于 pDNA 分离，使用这些系统，可以达到高 pDNA 结合载量（高于 10 mg/mL）。就整体柱而言，它们显示出了更高的孔隙率和更大的流通孔，这使得流动相能够轻松地穿过支持物，并且使其在层析系统中具有更高的渗透性和更低的背压。这些独特的特性可以在很短的工艺时间内实现快速高效的分离，减少产品降解和缓冲液消耗，同时不会降低分辨率和分离效率。Tarmann等使用不同的层析支持物来比较它们与 CIM-DEAE 整体柱的性能，发现这种支持物具有最快的吸附速率和最高的结合载量（13 mg pDNA/mL）。在另一种方法中，使用了吡啶修饰的整体柱，关注点是 HIC 策略，在核酸纯化方面取得了有趣的结果。在该研究工作中，获得了 3 mg/mL 的 pDNA 结合载量，研究还介绍了sc pDNA 的回收率，均一性为 98%，回收率为 96%。尽管如此，这种层析方法也存在一些缺点，即由于需要高盐浓度，并与其它步骤偶联，从而增加了操作时间和成本。
在用于从裂解物中分离 pDNA 的膜应用中，Pereira等使用一种以疏水性行为而闻名的线性烷基链配基修饰膜，能够将pVAX1-LacZ pDNA 从杂质中分离出来，特别是从RNA 中。然而，重要的是要指出，尽管这种膜可以将pDNA 从杂质中分离出来，但没有提到专门纯化sc pDNA 物质的尝试。质粒在流穿液中回收，收率为73%，纯度为 60%。这些膜的结合载量的表征显示出一个相当高的值，约为 32.5 mg/mL。该方法被描述为快速、简单且有效，能够减少 pDNA 纯化过程中的步骤数量。因此，重要的是要注意疏水相互作用的利用依赖于 pDNA 构型（即 sc 构型）和更疏水的核酸（如RNA、变性 gDNA、寡核苷酸和变性 pDNA 形式）之间的差异。这种现象的发生是由于存在高浓度的亲液盐，其与包装和屏蔽pDNA 分子的疏水碱基有关，从而导致与疏水基质的相互作用最小。另一方面，单链核酸显示出更高的疏水碱基暴露，因此与疏水配基强烈相互作用。关于内毒素，由于它们是高度疏水的分子，与pDNA 相比，在疏水柱中发生更强的相互作用。
另一种用于大分子纯化的替代方法，如pDNA，是冷冻凝胶。这些材料具有许多优点，包括它们的大孔和短扩散路径。冷冻凝胶的大孔，类似于以前报道的超多孔基质，将允许大的pDNA 分子渗透到内表面区域。对结合位点的高度可及性和可忽略的内部传质限制也是冷冻凝胶的特征，使其对pDNA 结合研究具有吸引力。然而，相比其它一些支持物，没有关于用于从其它 pDNA异构体中分离 sc pDNA 的冷冻凝胶的报道。
总体而言，为了提高选择性、载量、耐用性和成本效益等参数，研究人员不仅致力于层析支持物基本材料的改进，而且还非常关注配基的设计。研究人员主要尝试将优化的支持物与特定配基结合，以实现pDNA 纯化的最佳层析性能。
用于sc pDNA分离的特异性配基的设计
当前 pDNA的纯化工艺，特别是针对治疗性应用，需要多个层析步骤，这使得 pDNA 的生产不仅耗时而且成本高昂。在考虑 pDNA 纯化时，标准层析方法存在一些局限性。简而言之，AEXC 由于与阴离子交换树脂的非特异性结合，对 pDNA 的选择性较差，而 SEC 对pDNA 的载量和选择性有限，主要用作精纯步骤，在HIC中，尽管可有效分离pDNA 与内毒素以及单链核酸，pDNA洗脱发生在高盐浓度下，且异构体分离非常困难。为了抑制其中一些限制，AC采用特定的固定配基以及在有利于与支持物结合的特定条件下上样的目标生物分子相互作用，旨在促进尽可能高的pDNA 回收水平。由于提高了选择性，该技术可以在单个步骤中实现纯化。然而，只有当配基能够识别目标分子时，才能实现选择性和特异性，在这种情况下，目标分子是sc pDNA。此前用于 pDNA 纯化的亲和策略包括 DNA 结合蛋白、三链DNA 形成、芳香亲和层析和氨基酸亲和层析。
图3. sc pDNA 的理想纯化方法示意图。（一）复杂进样料液；（二）理化条件的建立；（三）高载量支持物；(IV) 目标分子的生物特异性识别；(V) sc pDNA 目标分子的高回收率和纯度水平。
对于这种方法，已经使用 DNA 结合蛋白作为配基建立了核酸分离策略。Woodgate等使用与谷胱甘肽-S-转移酶融合的双功能锌指(ZNF) DNA 结合蛋白从复杂的裂解物中分离pDNA。然而，使用这种方法只能观察到 10% 的收率，并且没有给出关于 pDNA 洗脱的数据。该研究小组还使用了一种不同的异源功能蛋白Lacl-His6-GFP，在这种情况下，他们将 pDNA 的回收率提高到 80% 以上，并在最终pDNA 产物中实现了高纯度，不含可检测到的RNA和蛋白质，且尽可能地降低了基因组DNA 污染。另一种策略是基于三螺旋亲和性，包括在胸腺嘧啶(T) 和腺嘌呤 (A) 之间形成 Hoogsteen 氢键，以形成TAT 三链体，或在特异性识别鸟嘌呤 (G) 的质子化胞嘧啶 (C+) 之间形成形成CG-C + 三链体。为了保证这些三链体在使用过程中的稳定性，必须使用酸性pH 值。pDNA 的结合通过以生物素化寡核苷酸作为配基的分子间三链体形成发生，并且通过用温和的碱性缓冲液加载柱子来实现回收，该缓冲液负责破坏Hoogsteen H 键的稳定性。Sherman等使用这种层析法纯化质粒 pXL2563，该质粒含有针对与所用琼脂糖柱共价结合的CTT 寡核苷酸的多聚 GAA 序列。最高的质粒回收率为 42%，杂质被消除（对于RNA）或显著降低（对于蛋白质和 gDNA）。一个较少探索但仍然很重要的策略与使用芳香亲和配基有关，这是最常见的六元环苯。这些化合物可以完全分离sc 构型，描述的纯度水平在 98.8% 和 100% 之间，回收率约为100%。
表3. 不同配基和支持物对pDNA吸附、回收和纯度的影响。
在过去的几年中，氨基酸也被用于亲和层析，作为模拟生物有机体中核酸和蛋白质之间发生的自然相互作用现象的一种方法。迄今为止，精氨酸、组氨酸、蛋氨酸等氨基酸已成功应用于分离sc pDNA 构型（表 3）。这些特定的配基被证明是一种很有前途的 pDNA 纯化方法，能够选择性地生物识别 sc pDNA 构型并消除其余的 pDNA 构型和其它杂质。这些亲和配基的主要优点是可以与sc pDNA 建立多种相互作用（疏水、静电、阳离子-π、范德华力和/或氢键），从而促进针对目标生物分子的亲和性，导致更有效和选择性的分离。此外，对于其中一些配基，通过调整结合和洗脱条件，例如温度、流速和缓冲液成分（pH、离子强度或竞争物质的存在），使该方法具有更高的通用性。当氨基酸固定在基球上时，scpDNA 纯度水平在 97% – 100% 之间，回收率在 40% – 70% 之间。同样重要的是，尽管选择性非常重要，但理想的层析支持物也应该能够促进大量纯pDNA 的分离。关于这一点，已经做出了一些尝试，将这些配基的选择性与现代化的支持物的载量结合起来，例如，使用整体柱。如表 3所示，当用不同的配基修饰整体柱并用于获得pDNA 时，这种生物分子的纯度水平在 98.3 – 100% 之间，回收率为 45.3 – 91.3%。此外，当评估不同支持物的载量时，众所周知，整体柱的pDNA 结合载量明显高于基于基球的传统层析支持物。例如，当组氨酸固定在基于琼脂糖的基质上时，所达到的最大DBC 约为 0.5 mg/mL，而将相同氨基酸固定在整体柱支持物上产生的 DBC 约为 11 mg/mL。此外，精氨酸（一种经过充分研究的、用于sc pDNA 分离的配基）被固定在两种类型的支持物中，发现整体柱的DBC 更高（5.18 mg/mL），而琼脂糖支持物为1.11 mg/mL。
对最合适的配基的寻求致使研究人员使用能够促进与目标分子的多种不同元素相互作用的多模式配基。这种类型的配基具有多个活性位点，可以同时实现离子和疏水相互作用，并且可以在层析运行期间通过调整实验条件和组合梯度进行不同的探索。这种多功能性通常会增加层析工艺的选择性和特异性。
例如，氨基酸衍生物，如组胺，已经在该领域被开发利用，以完成sc pDNA 的纯化。ˇCernigoj等利用组胺的疏水性（来自咪唑基团）和离子行为（来自氨基基团），结合下降的 pH 梯度以及 (NH4 )2SO4的使用，从oc 和 sc pDNA 组成的样品中分离 pDNA。在另一项研究中，Silva-Santos等使用了市售的含N-苄基-N-甲基乙醇胺配基的多模式基质 Capto adhere，在这项工作中，其利用了来自苄基的疏水相互作用以及来自该配基的胺和羟基的离子相互作用。结果表明，在第一个峰中收集的91.8% 的 pDNA 是 oc 形式，而在第二个峰中收集的92.2% 的 pDNA 是超螺旋的。
目前，对理想配基的追求促使科学家们探索生物信息学工具并将其与分子对接相结合。所有这些技术工具将研究人员的亲和配基设计能力提升到了一个新水平，因为他们可以使用组合方法系统地生成和筛选大量新化合物。关于组合方法，已经有一些研究使用具有不同连接分子（如三嗪或Ugi）的不同支架来快速轻松地寻找合适的亲和配基，以用于回收目标生物分子。此外，使用这些连接分子，可以在同一层析基球上使用和/或结合配基，例如 DNA 结合蛋白、氨基酸、核苷酸等，以提高sc pDNA 回收率和纯化产量。该策略旨在调节配基和目标分子之间发生的特异性相互作用，结合静电、疏水相互作用、范德华力和/或氢键。然而，据我们所知，目前没有研究工作利用这些技术进行 pDNA 层析。然而，很容易发现各种模拟 DNA 与肽或药物连接，以用于其它类型应用的研究，这为在特异性配基设计中使用这些技术，以优化pDNA 层析方法提供了机会。
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原文：J.F.A.Valente,J.A.Queiroz, F.Sousa, Dilemma on plasmid DNA purification: binding capacity vsselectivity. Journal of Chromatography A, 2021, 1637:461848.
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